尊龙凯时细胞培养指南

培养条件

进行细胞培养时，使用的气相条件为95%空气和5%二氧化碳。培养温度设置在37℃，并使用DMEM培养基，添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）。A-673细胞系来源于一名15岁女性的横纹肌肉瘤细胞，具有在软琼脂中形成克隆的能力，并可在免疫抑制的小鼠中形成肿瘤。该细胞系有多个标志染色体，包括一个额外的F染色体和两个异常的B染色体。

传代方法

建议初次传代比例为1:2。传代期间，每两天更换培养基。收到细胞后，先进行处理使其处于良好状态，然后将其灌满完全培养液并密封瓶口，这样是运输细胞的最佳方法。接收细胞时，用75%酒精喷洒整个细胞瓶以进行消毒，然后在超净台内进行无菌操作。将细胞瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态，之后再进行处理。显微镜下观察细胞生长情况，并记录不同倍数下的照片（建议记录40X、100X和200X各一张）。前三天的照片是售后支持的重要依据，若未提供照片默认状态良好。

细胞培养步骤

细胞传代

若细胞汇合度未超过80%，将培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基并继续在37℃、5% CO2培养；如果细胞密度超过80%，则可进行传代。贴壁细胞传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS轻轻洗涤细胞1-2次。
2. 添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞状态，待细胞变圆并脱落后，迅速回到操作台，轻轻敲击培养瓶，添加5ml以上完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，并在1000 RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬细胞。
4. 按照1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），并补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。

悬浮细胞传代

悬浮细胞的传代步骤如下：

1. 使用半换液法，将培养瓶竖放在培养箱中静置约1小时，轻轻吸去3ml左右培养基，再补充3ml完全培养基，如培养基变色较慢，可添加约500ul的FBS。传代时可以直接补充5ml培养基分为两个培养瓶，通常在传代3次后可离心传代一次，去掉死细胞。
2. 如果需要分瓶，可以将细胞悬液收集至离心管中，在1000 RPM下离心5分钟，弃去上清后补充1-2ml培养液重悬，然后按1:2的比例分配至新的T25瓶中，添加6-8ml新配制的完全培养基以保持细胞活性。之后的传代可根据实际情况按1:2至1:5的比例进行。

细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%时，弃去培养液并用PBS洗涤细胞一次。
2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶，倒置在显微镜下观察，待细胞收缩变圆后加入5ml完全培养基以终止消化，轻轻吹打细胞使其脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清后，将沉淀的细胞加入1ml无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存管放入-80℃冰箱保存。如果后续需要转入液氮罐，需在-80℃冰箱中存放超过24小时后再转移。

细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管时注意佩戴防护面具，并将其迅速放入37℃水浴中解冻，直至冻存管内无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，以1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清后，用5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶，并放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
4. 第二天更换新鲜的完全培养基继续培养。

注意事项

在运输过程中，有些细胞可能会脱落，这是正常现象。如果不慎脱离较多，可将所有培养液收集至离心管，1000 RPM离心5分钟，收集上清作过渡培养（后期对比培养）。沉淀中加入1-2ml胰蛋白酶，轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止反应。再次离心，弃去上清，并加入1-2ml完全培养基重悬，然后按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。

通过采用尊龙凯时的细胞培养指南，可以有效提高细胞培养的成功率和细胞活性，保障研究和实验的顺利进行。