团队首先采用染色质相关蛋白的纯化与高分辨率质谱分析方法，筛选识别出HSF5作为一种生精细胞染色质相关蛋白。通过荧光共定位技术，进一步确认HSF5在生精细胞中具有特异性的核定位模式，其表达始于早期至中期的粗线期精母细胞，并持续存在，直至圆形精子阶段约step 4时消失，这提示HSF5在减数分裂过程中可能发挥重要作用。

研究团队利用CRISPR-Cas9技术构建了Hsf5基因敲除（Hsf5KO）小鼠模型。观察到Hsf5KO的成年小鼠表现出雄性不育，睾丸组织的形态学分析显示，Hsf5KO小鼠的附睾精子缺乏，且睾丸管腔内的圆形精子和长形精子均缺失，同时伴随着大量生精细胞的凋亡。进一步的染色体铺展实验发现Hsf5KO小鼠的精子发育停滞在中晚期的pachynema阶段，并且在这些停滞的精母细胞中，DNA双链断裂（DSB）修复、联会重组以及减数分裂性染色体沉默（MSCI）等生物学过程并未显现出明显异常。这些结果提示，HSF5可能参与调控粗线期进程后期的生物学事件，而非早期阶段的DSB修复、联会重组及MSCI过程。

为进一步探讨HSF5基因在粗线期中晚期过程中的具体作用，研究团队结合单细胞测序（scRNA-seq）和Cleavage Under Target & Tagmentation（CUT&Tag）测序技术进行多组学联合分析。单细胞测序结果显示，Hsf5KO精母细胞停滞在“pachytene-like（P-like）”状态，与野生型小鼠的粗线期精母细胞相比，P-like精母细胞的转录谱出现显著异常，包括Wee1、Dmc1和Msh5等粗线期细胞检查点基因的高表达，这可能最终导致精母细胞的凋亡。结合CUT&Tag数据分析发现，受HSF5直接靶向调控的基因如Sycp1、Meiob、Msh4等表现出异常高表达。然而，通过RNA转录动力学（RNA transcriptional dynamics）分析显示，野生型小鼠粗线期精母细胞在早期至晚期的转录过程中，Sycp1、Meiob、Msh4基因的表达逐渐降低，但在Hsf5KO小鼠中，这些基因的转录持续保持在高水平，并未显示出逐渐降低的趋势。

此外，HSF5可能与SMARCA5、SMARCA4以及SMARCE1等染色质重构复合体蛋白相互作用，调控Sycp1、Meiob、Msh4等基因的表达，以确保pachynema阶段的顺利进行，从而为后续的减数分裂解除联会阶段做准备。总体而言，该研究揭示了HSF5在精母细胞减数分裂pachynema过程中及其与雄性不育之间的新分子机制模型。在减数分裂过程中，HSF5通过与SMARCA5、SMARCA4和SMARCE1相互作用抑制特定基因（如sycp1、Meiob、Msh4和Hat1）的表达；而在pachynema过程后期，HSF5则直接或间接促进Hspa2、Ccnb1和Plk1等基因的表达。HSF5介导的基因调控确保了精母细胞顺利完成减数分裂pachynema阶段，并为后续解除联会阶段做好准备。

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